گزیلاناز یا زایلناز (Xylanase)

گزیلاناز­ها از اعضای آنزیم­های گلیکوزیدازها[1] (O-glycoside hydrolases)  هستند که هیدرولیز پیوندهای بتا 1و4 گلیکوزیدی در گزیلان­ها را کاتالیز می­کنند. گزیلاناز­هایی گوناگونی با تاخوردگی­[2]ها، مکانسیم کاتالیکی، خواص فیزیکی ـ شیمیایی و سوبسترای ویژه توسط گروه وسیعی از موجودات مانند قارچ­ها (Polizeli, Rizzatti et al. 2005)، باکتری­ها (Gilbe and Azlewood 1993)، مخمرها (Parachin, Siqueira et al. 2009) و گیاهان(Suzuki, Kato et al. 2002) تولید می­گردند. اولین گزارش از آن در سال 1955 بود و نام پنتوزانزها[3] برای آن در نظر گرفته شد تا اینکه در سال 1961 شورای بین المللی بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی (IUBMB) بر اساس ویژگی به سوبسترا و نوع واکنش این آنزیم، کد EC 3.2.1.8  را برای آن در نظر گرفت (Collins, Gerday et al. 2005). نام رسمی این گروه از آنزیم­ها Endo-1,4-β-Xylanase است ولی نام­های Xylanase, Endoxylanase, 1,4-b-D-xylan-xylanohydrolase, β-Xylanase Endo-1,4-β-D-Xylanase و β-1,4-Xylanase  نیز برای آن­ها رایج است.

[1] Glycosidases

[2] Fold

[3] Pentosanases

برای بررسی هر چه دقیق­تر این گروه از آنزیم­ها که موضوع اصلی این تحقیق است نیاز به پاره­ای از توضیحات و اصطلاحات می­باشد که در ادامه به آن پرداخته می­شود.

1-7-1- طبقه بندی گلیکوزید هیدرولازها

گلیکوزید هیدرولازها[1] (EC 3.2.1.x)گروه وسیعی از آنزیم­ها هستند که پیوندهای گلیکوزیدی کربوهیدرات­ها را می­شکنند. نام گذاری IUBMB  بر اساس اختصاصیت سوبسترا و گاهی مکانیسم مولکولیشان می­باشد که البته منعکس کننده­ی ساختار آنزیم­ها نیست. به همین خاطر طبقه بندی در سال 1991 پایه گذاری شد و مبنای آن مشابهت توالی اسید آمینه­ای در قسمت کاتالیکی [2]گلیکوزید هیدرولازها بود. یک طبقه از گلیکوزید هیدرولازها را با خانواده[3] نمایش می­دهند و شماره­ای به آن اختصاص یافته است، برای مثال خانواده 10 گلیکوزید هیدرولاز ( به­صورت مخفف GH 10).  این طبقه بندی نمایانگر اطلاعاتی از قبیل مشخصات ساختاری، روابط تکاملی و مکانیسم کاتالیکی مشترکی از آنزیم­های یک خانواده می­باشد (Henrissat 1991; Henrissat and Bairoch 1993). این طبقه بندی با قابلیت به روز شدن در پایگاه اطلاعاتی CAZy (Cantarel, Coutinho et al. 2009) وجود دارد.

بر اساس این طبقه بندی گزیلنازها در خانواده­های 5، 7، 8، 9، 10، 11، 12، 16، 30، 43، 44، 51 و 62 قرار دارند ولی لازم به ذکر است که تنها خانواده­های 5، 8، 10، 11و 43 (بیشتر گزیلان­ها در این خانواده­ها قرار دارند) داری یک بخش  کاتالیکی  گزیلناز می­باشند و بقیه­ی خانواده­ها دارای دو[4] یا چند بخش[5] کاتالیکی به جز گزیلناز می­باشند.

1-7-2- زیرجایگاه

زیرجایگاه[6] گزیلنازها بیشتر از تعدادی اسید آمینه آروماتیک تشکیل شده است که دیواره­ی داخلی جایگاه فعال[7] (جایگاه اتصال سوبسترا[8]) را دربرگرفته­اند. زیرجایگاه­ها نواحی مطابق با واحدهای مونومری گزیلوز یا آرابینوز هستند به­طوری­که اسید آمینه­های تشکیل دهنده­ی آن با سوبسترا از طریق پیوندهای هیدروژنی یا هیدروفوبیک برهم­کنش دارند (Pollet, Delcour et al.). تعداد زیرجایگاه­ها در گزیلنازها متفاوت بوده و نقش حیاتی در شناسایی سوبسترا دارند (Jeffries 1996). شماره­گذاری زیرجایگاه­ها از n- تا n+ می­باشد، به­نحوی­که ناحیه­ی اتصال اسید­آمینه به سمت گلیکون[9] (انتهای غیرکاسته شده[10]) سوبسترا را با شماره­های منفی نام­گذاری می­کنند و بالعکس ناحیه­ی اتصال اسید­آمینه به سوی آگلیکون[11] (انتهای بریده شده[12]) را با شماره­های مثبت نشان می­دهند. در ضمن ناحیه کاتالیکی ـ یعنی جایی که پیوند شکسته می­شود ـ دقیقا بین زیرجایگاه 1- و 1+ قرار دارد (Davies, Wilson et al. 1997). شکل 1-5 تصویر شماتیک از زیرجایگاه و نحوه­ی شمارگذاری آن را به تصویر کشیده است.

[1] Glycoside hydrolases 

[2] Catalytic module

[3] Family

[4] Bifunctional

[5] Multidomain

[6] Subsite

[7] Active site

[8] Substrate-binding site

[9] Glycon region

[10] Non-reducing end

[11] Aglycon region

[12] Reducing end

– مکانیسم کاتالیکی گزیلنازها

گزیلنازها همانند دیگر گلیکوزید هیدرولازها، پیوندهای گلیکوزیدی را با استفاده از کاتالیز کننده­های اسید- باز برش می دهند. این کاتالیز ممکن است با مکانیسم وارونگی[1] یا نگهداری[2] ساختار آنومری سوبسترا انجام شود. این مکانیسم­ها در شکل 1-6 به تصویر کشیده شده است.

وارونگی، یک واکنش جابجایی ساده است. یک اسید کاتالیک برای عزیمت گروه ترک کننده، پروتونی در اختیارش قرار می­دهد (هیدروکسیل­های گلیکوزیدی، pk_a بالایی دارند و بنابراین گروه­های ترک کننده­ی ضعیفی هستند). در حالی که برای جابجایی نوکلئوفیلی در مرکز آنومری، لازم است یک باز کاتالیک، آب را دپروتونه کند. معمولا باید اسید و باز نزدیک به 7 تا 13 آنگستروم از یکدیگر فاصله داشته باشند تا آب نوکلئوفیل در پایین دست حلقه­ی پیرانوزید قرار گیرد (Rye and Withers 2000).

مکانیسم نگهداری، یک جابجایی دوتایی است که سیمای کلی آن در سال 1953 به وسیله­ی کوشلند بیان شد. بنا بر این مکانیسم، یک حدواسط کوالان آنزیم ـ گلیکوزیل ساخته و سپس تجزیه می شود. این امر نیازمند دو آمینو اسید ضروری است: یک نوکلئوفیل آنزیمی و یک اسید/ باز کاتالیک که در ابتدا به عنوان اسید برونشتد کلاسیک عمل می­کند، به این ترتیب که گروه ترک کننده را پروتونه می­کند تا به عزیمت آن کمک کند. سپس به عنوان یک باز عمل می­کند. در مرحله­ی بعد، آب نوکلئوفیل حاصل را دپروتونه می­کند. در همه­ی سیستم­های مطالعه شده تاکنون، نوکلئوفیل و اسید/ باز نزدیک به 5 تا 6 آنگستروم با یکدیگر فاصله دارند. از آنجا که مکانیسم کاتالیک، از طریق جابجایی گروه­های عامل بر سطح پروتئین انجام می­شود، شیمی فضایی کاتالیز درون هر خانواده حفظ شده است (White and Rose 1997).

[1] Inversion

[2] Retention

در هر یک از خانواده­های گلیکوزید هیدرولازها، یکی از مکانیسم­های یاد شده صورت می­پذیرد. به این ترتیب، ناحیه­ی کاتالیتیک هر یک از خانوادهای گزیلناز، ساختار فضایی مخصوص به خود را دارند و عمل هیدرولیز را روی سوبسترایی با ساختار فضایی ویژه انجام می­دهند. با این توضیح که  خانواده­های 5، 10و 11 مکانیسم حفظ، و خانواده­های 8 و 43 مکانیسم وارونگی ساختار فضایی را دارند (Pollet, Delcour et al. 2010).

1-7-4- خانواده­های مهم گزیلنازها

در ادامه دو خانواده­ی مهم از گزیلنازها که بیشتر پژوهش­ها بر روی آنها انجام شده است به تفصیل مورد بررسی قرار می­گیرد.

1-7-4-1- گزیلنازهای خانواده­ی گلیکوزید هیدرولاز 10 (GH 10)

این خانواده معمولا وزن ملکولی بالا و pI پایینی دارند.

1-7-4-1-1- ویژگی سوبسترا[1]

بیشتر گلیکوزید هیدرولازهای این خانواده را “بتا 1و4 گزیلناز” تشکیل می­دهد. مشخصه­ی “گزیلنازهای 10” گستردگی عمل بر سوبستراهای مختلف می­باشد،  به ­طوری­ که نه تنها سوبسترای خطی گزیلان را مورد حمله[2] قرار می­دهند بلکه همچنین جایگاه فعالشان[3] را با اولیگوگزیلوساکاریدها و هتروگزیلان­های شاخه­دار[4] وفق می­دهند. آنالیز محصولات حاصل از هیدرولیز “گزیلنازهای 10” بیانگر این است که آنها پیوند گلیکوزیدی که در “انتهای کاهش نیافته” پلی­مر گزیلان آن یک یا دو گزیلوزش توسط قندهای دیگر شاخه­دار شده را کاتالیز می­کنند و برای هیدرولیز کردن تنها به دو مونومر (گزیلوز) بدون شاخه در بین گزیلوزهای شاخه­دار نیاز دارند (شکل 1-7) (Pollet, Delcour et al. 2010). “گزیلناز 10” در مقایسه با “گزیلناز11” بروی اولیگوگزیلوساکاریدها فعالیت بیشتر دارند و در هنگام هیدرولیز گلوکورونوگزیلان و آرابینوگزیلان قطعات کوچکتری تولید می­کنند. تمامی گزیلنازهای شناسایی شده در گیاهان از اعضای این خانواده هستند (Pollet, Delcour et al. 2010). علاوه بر این اعضای این خانواده بر روی سوبستراهای مشتق شده از گلوکز با وزن ملکولی پایین، فعالیت نشان می­دهند و نسبت به جانشینی گلوکز به جای یک یا دو گزیلوز در پلی­مر گزیلان انعطاف پذیری نشان می­دهند (Collins, Gerday et al. 2005). در هیدرولیز هموگزیلان­هایی که در آن مخلوط دو پیوند “بتا 1و3” و “بتا 1و4” وجود دارد، تمام پیوندهای “بتا 1و3” بین دو پیوند “بتا 1و4” شکسته می­شوند ولی پیوندهای “بتا 1و4” که قبل از پیوند “بتا 1و3” قرار دارند مورد حمله واقع می­شوند و پیوند “بتا 1و4″یی که بلافاصله پس از “بتا 1و3” در سمت “انتهای بریده شده” واقع شده، هیدرولیز نمی­گردد (شکل1-6) (Pollet, Delcour et al. 2010).

1-7-4-1-2- ساختار قسمت کاتالیکی[5]

قسمت کاتالیکی این آنزیم­ها دارای تاخوردگی (β/α)₈-barrel fold بوده و با نام TIM-barrel fold نیز می­شناخته می­شوند که شبیه یک “کاسه سالاد” می­باشد. این ساختار در این خانواده بسیار حفاظت[6] شده است و تنها شکل آن بین دایره و بیضی کامل متغیر می­باشد (Pollet, Delcour et al. 2010).

1-7-4-1-3- توپولوژی جایگاه فعال و اتصال لیگاند

دو اسید آمینه گلوتامیک نزدیک “C-ترمینال” β-strands 4و 7 قسمت کاتالیکی مسوول مکانیسم عمل آنزیم هستند. “گزیلنازهای 10” معمولا 4 تا 7 (بیشتر 5 یا 6) زیرجایگاه دارند. به­طور­ کلی زیرجایگاه­های 1+، 1- و 2- بسیار حفاظت شده­اند و این اسید آمینه­ها نقش کلیدی در شناسایی سوبسترا دارند. به­طوری که در ناحیه­ی گلیکون، گزیلوزها با پیوند هیدروژنی به اسید آمینه­ها متصل می­شوند و در ناحیه­ی آگلیکون از طریق پیوند هیدروفوبیک اتصال بین حلقه­های گزیلوپیرانوزها و اسید آمینه­ها صورت می­گیرد (Pollet, Delcour et al. 2010).

[1] Substrate specificity

[2] Attack

[3] Active-site clefts

[4] Decorated heteroxylans

[5] Catalytic domain

[6] Conserved

1-7-4-1- گزیلنازهای خانواده­ی گلیکوزید هیدرولاز 11 (GH 11)

برخلاف دیگر خانواده­های گزیلنازها، “گزیلنازهای 11” تنها خانواده­ای است که فقط دارای فعالیت اندو بتا 1و4 گلیکوزیدازی هستند (true xylanases). “گزیلنازهای 11” بر اساس pH بهینه[1] به دوگروه اسیدی و قلیایی تقسیم می­شوند (بین 12-2). مطالعات نشان داده pH بهینه فعالیت مربوط به اسید آمینه­ی مجاور جایگاه مکانیسم آنزیمی است به نحوی که اگر این اسید آمینه اسپارتیک باشد pH بهینه اسیدی است ((pH<5 و اگر آسپارژین باشد pH بهینه آن قلیایی است (ph≥5) (Pollet, Delcour et al. 2010). این خانواده معمولا pI بالا داشته و از وزن ملکولی پایینی برخوردار هستند.

1-7-4-2-1- ویژگی سوبسترا

این خانواده تنها بر روی سوبستراهای گزیلان فعالیت می­کنند و قادر به هیچگونه عملکرد بر روی سوبستراهای گلوکز یا مشتقات آن نیستند. بیشترین محصول بدون شاخه­ی بدست آمده از هیدرولیز هتروگزیلان­ها، گزیلوبیوز[2] و گزیلوتریوز[3] می­باشد. این گروه از گزیلان­ها هیچگونه فعالیت کاتالیکی بر روی گزیلوبیوز و گزیلوتریوز ندارند و با وجود این­که فعالیت بسیار پایینی بر روی گزیلوتتروز[4] دارند، گزیلوپنتوز[5] و گزیلوهگزوز[6] را به سرعت می­شکنند (Pollet, Delcour et al. 2010).

این گزیلنازها نمی­توانند پیوند گلیکوزیدی جنب یک گزیلوز شاخه­دار در “انتهای غیر کاسته شده” را بشکنند و برای هیدرولیز نیازمند حداقل سه گزیلوز بدون استخلاف در بین دو گزیلوز شاخه­دار هستند (شکل 1-7). کوچکترین محصول کاتالیز هتروگزیلان­های مخلوط در این خانواده گزیلوتریوز می­باشد که یک پیوند “بتا 1و3” در میان دو پیوند “بتا 1و4” می­باشد (Pollet, Delcour et al. 2010).

1-7-4-2-2- ساختار قسمت کاتالیکی

قسمت کاتالیکی این خانواده دارای تاخوردگی β-jelly roll structure است که شبیه دست راست می­باشد، بدین شکل که دو β-sheets انگشت­ها را تداعی می­کنند و کف دست را α-helix و قسمتی از یکی از β-sheets های یاد شده، تشکیل می­دهند. این ساختار نیز در آنزیم­های این خانواده بسیار حفاظت شده است (Paes, Berrin et al. 2011).

1-7-4-2-3- توپولوژی جایگاه فعال و اتصال لیگاند

در این خانواده دو اسید آمینه گلوتامیک واقع در قسمت کف دست عامل انجام مکانیسم هیدرولاز هستند و همچنین بیشتر آنها دارای 5 یا 6 زیرجایگاه هستند که بسیار حفاظت شده­اند (Pollet, Delcour et al. 2010).

[1] pH-optima

[2] Xylobiose

[3] Xylotriose

[4] Xylotetraose

[5] Xylopentaose

[6] Xylohexaose