کاربرد آنزیم ها در صنایع لبنی

لبنیات

محصولات لبنی از مثال های کلاسیک مواد غذایی تخمیری هستد و سابقه آنها به چندین هزار سال قبل بازمی گردد. طی قرن ها، محصولات لبنی متنوعی بر اساس آزمایشات تجربی بشر شناخته شدند. فهم بیوشیمیایی، میکروبی و فیزیولوژیکیِ این فرایندها از نیمه دوم قرن 19 آغاز شد. پژوهش ها در این زمینه همواره با تجارت و اقتصاد گره خورده است. تاکید بر طعم و بافت محصول لبنی منجر به تولید پنیرها و دسرهای مختلف شده است. آنزیم های منشا گرفته از مواد خام، کشت های استارتر میکروبی یا دیگر منبع ها ابزاری اولیه برای بهبود محصولات لبنی بوده اند.

پنیر سازی

فرایند کلیدی در پنیرسازی لخته یا دلمه کردن شیر است. شیر بر اثر آنزیم های لخته ساز ساختار ژلی می گیرد. پروتئین های کازئین در شیر پایداری کلوئیدی شان را از دست می دهند و ژل می شوند. پس از برش ژل، بخش مایع آب پنیر (whey) شامل پروتئین وی، مواد معدنی و لاکتوز از لخته های کازئین جدا می شوند. مواد کازئینی یا همان دلمه در قالب ریخته می شود. پس از پرس کردن و نمک افزودن پنیر تحت شرایطی نگهداری می شود تا عمل آوری شود. زمان نگهداری بسته به نوع پنیر از چند هفته تا چند سال است.

مکانیسم رنت

حدود 80% پروتئین های شیر کازئین است که به طور طبیعی هیدروفوب (آبگریز) است. کازئین گاوی بر اساس میزان انحلال پذیری در آب به چهار زیرگروه از فسفوپروتئین ها دسته بندی می شود که آگلومره هستند. این چهار زیرگروه عبارتند از کازئین های αs1،  αs2، β و κ. کازئین ها اگریگیت می شوند تا ساب میسل ها را بسازند. آنها نیز با هم میسل های کازئین را می سازند. سطح بیرونی کازئین های میسل شامل ساب میسل هایی دارای مقدار زیادی کازئین کاپا است. بخش های آب دوست و مثبت بارِ کازئین کاپا از میسل بیرون می زنند و بر اساس برهم کنش های ضعیف میسل را پایدار می کنند. آنزیم های لخته کننده مشخصا این بخش های آبدوست را از میسل ها جدا می کنند. اینها پیوند فنیل آلانین – متیونین را در موقعیت 105-106 هیدرولیز می کنند تا میسل ناپایدار شود. به این ترتیب میسل ها با هم جمع می شوند. بخش آبدوستِ جدا شده نیز پپتید کازئینو مارکو است. یون های کلسیم بر تجمع میسل های کازئین اثر می کنند ولی بر عملکرد آنزیم ها اثری ندارند. واکنش آنزیمی به pH بسیار حساس ولی به دما چندان حساس نیست. تجمع میسل ها به شدت به دما بستگی دارد. بنابراین  اثر رنت، حذف بخش آبدوست میسل های کازئین و کمک به تجمع آنهاست.

انواع منعقد کننده ها

منعقد کنده های تجاری مورد استفاده در پنیرسازی شامل رنت جانوری و میکروبی به دست آمده از میکروارگانیسم های GM و غیرGM هستند. رنت جانوری اغب از معده پستانداران جوان به ویژه گوساله ها استخراج می شود. رنت جانوری شامل کیموزین و پپسین (E.C. 3.4.23.1) است. نسبت کیموزین به پپسین به سن جانور بستگی دارد. این نسبت در گوساله های نوزاد حدود 95% است.

به دلیل محدودیت منابع رنت جانوری، رنت های میکروبی مطرح شدند و امروز سهم عمده بازار را دارند. منعقدکننده های میکروبی از تخمیر حاصل می شوند. رنت اغلب از گونه های Rhizomucor michei، R. pussilus و Cryphonecria parasitica به دست می آید.

دسته سوم منعقد کننده ها از میکروارگانیسم های مهندسی شده به دست می آیند. ژن کدکننده کیموزین نوع B در گوساله در در ژنوم قارچ ها و مخمرهایی از قبیل Aspergillus oryzae و Kluyveomyces kactis کلون می شوند. کیموزین نوع A که در E. coli کلون و بیان می شود دیگر به شکل تجاری در دسترس نیست زیرا تولید آن کاربرد تجاری ندارد.

در برخی پنیرها از پروتئازهای گیاهی متعلق به کنگر و Solanum fobium استفاده می شوند. منعقد کننده ها به شکل مایع، پودر، قرص و خمیر وجود دارند. رنت جانوری نیز با نسبت استانداردی از کیموزین و پپسین تهیه می شود.

ویژگی های آنزیم های منعقد کننده

همه آنزیم های منعقد کننده آسپارتیک اندوپروتئاز هستند. دو آسپارتیک اسید در کنشگاه آنزیم وجود دارند که نقش کلیدی در فعالیت آنزیم دارند. همه منعقدکننده ها کمابیش توسط پپستاتین (یک اولیگوپپتید میکروبی متعلق به استروپتومایسس ها) مهار می شوند. آنزیم های منعقد کننده میکروبی شباهت توالی زیادی با هم دارند، ولی با منعقد کننده های جانوری بسیار متفاوتند. منعقد کننده های جانوری (کیموزین و پپسین) به فرم نافعال ترشح شده و سپس فعال می شود، ولی انواع میکروبی از آغاز فعالند.  جدول 1 ویژگی های بیوشیمیایی آنزیم های منعقد کننده را ارائه می کند.

کیموزین جانوری دو نوع A و B دارد که تنها در یک آمینو اسید متفاوتند. نوع A ناپایدار تر و اختصاصی تر است. کیموزین معیاری برای دیگر آنزیم های رنت است. این آنزیم اختصاصا پیوند فنیل آلانین-متیونین را در کازئین کاپا می شکند. در pHهای اسیدی، آسپارتیک پروتئازها اختصاصیت شان را از دست می دهند و به طور تصاوفی پروتئین ها و حتی خودشان را هیدرولیز می کنند. به جز منعقد کننده متعلق به C. parasitica که پیوند 105-106 را در کازئین کاپا هیدرولیز می کند، دیگر منعقد کننده ها پیوندهای فنیل آلانین- متیونین را در کازئین کاپا هیدرولیز می کنند. رنت های میکروبی پروتئولیتیک تر از رنت های جانوری هستند. نسبت بین مقدار شیر لخته شده و آنزیم استفاده شده به عنوان شاخص کیفیت آنزیم های منعقد کننده استفاده می شود. این شاخص به pH نیز بستگی دارد. در pH6.5، کیموزین میکروبی بیشترین نسبت یاد شده را دارد، سپس رنت گوساله، پپسین گاو، و پروتئازهای متعلق به R. pusillus، R. miehei و C. parasitica هستند. این نسبت در تولید اقتصادی پنیر بسیار مهم است. جدول 2 مقایسه ای میان انواع منعقد کننده ها دارد.

ناپایداری گرمایی آنزیم های منعقد کننده نیز مهم است. پنیرها برای نافعال شدن آنزیم ها در دمای 50 د.س تیمار می شوند. به همین دلیل تمایل به استفاده از رنت متعلق به C. parasitica زیاد است زیرا در این دما ناپایدار است. همه فعالیت پروتئولیتیک این آنزیم ها باید طی فرایند پاستوریزاسیون معمولی (12 ثانیه ر 72 د.س) نابود شود. کمترین پایداری را پپسین خوک دارد، سپس پپسین گاوی، C. parasitica، کیموزین، R. pusillus و R. miehie قرار دارند. حتی برای کاهش پایداری دمایی از مهندسی ژنتیک و پروتئین استفاده می شود. پایداری دمایی با کاهش pH افزوده می شود.

عمل آوری پنیر

عمل آوری پنیر عمدتا شامل شکستن کائین است. اندوپروتئازهایی از قبیل پلاسمینِ شیر و آنزیم های منعقد کننده مسئول تولید قطعات پپتیدی از کازئین هستند. اگزوپروتئازهای متعلق به استارترهای باکتریایی پپتید های حاصل از تجزیه کازئین را تا سطح آمینو اسیدها تجزیه می کنند. این آمینو اسیدها پیش سازِ ترکیباتی هستند که توسط دیگر آنزیم های موجود در استاتر ساخته می شوند و طعم پنیر را تعیین می کنند. پس کشت های مختلف استارترها در نوع و کیفیت پنیر اثر دارند. آنزیم های منعقد کننده میکروبی برای پنیرهایی که عمل آوری طولانی دارند مناسب نیستند و پنیر را تلخ می کنند. البته دستکاری آنزیم ها موجب تغییر عملکردشان می شود.

جدار کردن لخته پنیر از آب پنیر مهم است. مواد معدنی و لاکتوز در لخته نمی مانند. باکتری ها و ذرات چربی در شبکه کازئین گیر می کنند و در پنیر می مانند. پروتئین ها بسته به برهم کنش شان با دیگر پروتئین ها به ویژه کازئین در پنیر می مانند. مثلا whey تقریبا به طور کامل از پنیر خارج می شود ولی لیزوزیم می ماند. باقی ماندن آنزیم های منعقد کننده نیز به pH هنگام جداسازی بستگی دارد. مثلا کیموزین در pH6.5 به میزان 15% در پنیر می ماند. در روش فراوری کاممبرت، جداسازی در pH6.2 انجام می شود که در آن 50% از کیموزین در پنیز باقی می ماند. رنت های میکروبی مستقل از pH حدود 18% در پنیر می مانند. مقدار رنت بازمانده در پنیر نقشی در عمل آوری پنیر در مرحله بعد دارد.

طعم پنیر و تسریع عمل آوری

پنیرهای سفت و فشرده دوره عمل آوری طولانی تر تحت دما و رطوبت خاص دارند که قیمت آنها را می افزاید. با استفاده از آنزیم ها تلاش می شود دوره عمل آوری کوتاهتر باشد تا پنیر اقتصادی تری تولید شود. بدیهی ترین راه،تسریع عمل آوری، افزایش دما است ولی این منجر به تغییر طعم و بافت پنیر می شود. چنانکه گفته شد، عمده ترین اتفاق طی عمل آوری تجزیه کازئین است. پس افزودن پروتئازها می تواند عمل آوری را تسریع کند. مشکل اینجاست که پروتئازها هنگام جداسازی لخته های پنیر درون آن نمی مانند. برای رفع مشکل روش هایی همچون کپسول کردن پروتئاز درون لیپوزوم، پیوند دادن آن به کازئین و … استفاده می شود. در پنیرهای چدار، که در آن به لخته ها نمک افزوده می شود، پروتئاز همراه با نمک افزوده می شود و هرچند به طور کامل کل بافت پنیر را تحت تاثیر قرار نمی دهد، ولی تا حدی موثر است. دیگر روش های پیشرفته نیز باعث افزایش قابل توجه قیمت پنیر می شود. روش دیگر برای تسریع عمل آوری پنیر تغییر در کشت های استارتر پنیر است، چه ژنتیکی و چه ترکیب آنها. مثلا می توان LAB (باکتری لاکتیک اسید) را به روش هایی همچون گرما یا مایکروویو کُشت، ولی فعالیت آنزیم های کاتالیتیکش را حفظ کرد. افزودن این ماده به کشت استارتر تعادل بهتری را نسبت به افزودن باکتری سالم ایجاد می کند.

لیپاز

چربی شیر عمدتا تری گلیسرید است و لیپازها آن را به مونو و دی اسیل گلیسرول ها، اسیدچرب های آزاد و گلیسرول تجزیه می کنند. لیپاز به ویژه در طعم پنیرهای عمل آوری شده با کپک، پنیرهای آبی و برخی پنیرهای ایتالیایی نقش دارد.

لیزوزیم

لیزوزیم تخم مرغ (مارمادیاز) قادر به شکستن پیوندهای سهیم در دیوار باکتری های گِرم مثبت است. لیزوزیم در شیر وجود دارد و در محیط اسیدی فعال است و فعالیتش تا دمای 100 د.س چندان کم نمی شود. در پنیر سازی از لیزوزیم  نیترات برای ممانعت از پف کردن پنیر استفاده می شود. پف کردن ناشی از ایجاد گازهای دی اکسید کربن و هیدروژن بر اثر فعالیت باکتری های بوتریک اسید به ویژه Clostridium tyrobutyricum است. همچنین در اثر فعالیت این باکتری ها، اسیدهای آلی فراری ساخته می شوند که طعم پنیر را نامطلوب می کنند. عملکرد لیزوزیم در حضور نمک مهار می شود، لذا بیشترین عملکرد آن قبل از نمک افزایی به پنیر است. لیزوزیم به اتصال به کازئین به راحتی در لخته های پنیر می ماند و فعالیت می کند.

هیدرولیز کننده های پروتئین شیر

میزان تجزیه پروتئین ها بر بسیاری از خواص محصول اثر می گذارد. خواص فیزیکوشیمیایی، الکتروشیمیایی، بارهای سطحی، آبگریزی، انحلال پذیری و… تحت تاثیر این پدید قرار می گیرند. همه اینها بر خواصی همچون بافت، طعم و رنگ و پایداری محصول اثر می گذارند. پس باید میزان هیدرولیز پروتئین های شیر به دقت کنترل شود. میزات هیدرلیز عموما بین 10 تا 40% است.

اندو و اگزو پروتئازها برای کنترل میزان هیدرولیز پروتئین، غلظت آمینو اسیدها، اندازه پپتیدها و حتی تعیین طعم پنیر استفاده می شوند. بسیاری پروتئازها همچون پپسین پانکراسی و تریپسین  یا پروتئازهای گیاهی همچون پاپِین و نیز آنزیم های صنعتی به دست آمده از میکروب ها استفاده می شوند. کنترل هیدرولیز شیر منجربه تولید محصولاتی همچون نوشیدنی های نیروزای ورزشی، غذای کودک، غذاهای رژیمی، و غذاهای افراد دیابتی می شود.

ترانس گلوتامیناز

این آنزیم نقشی کلیدی در تعیین بافت و رئولوژی محصولات لبنی دارد. این آنزیم منجر به ایجاد پلیمرهای پروتئینی بزرگی می شود که در آبدهی، امولسیون سازی و فوم سازی مواد غذایی ای همچون کازئین، سویا، ماهی و گوشت نقش دارد. در صنایع لبنی از این آنزیم برای تولید ماست، شیرهای کم چرب و خامه سازی استفاده می شود.

شیر بدون لاکتوز

بتاگالاکتوزیداز (E.C. 3.2.1.23) یا لاکتاز آنزیمی است که لاکتوز را تجزیه می کند. لاکتوز یک دوقندی شامل گلوکز و گالاکتوز است. مصرف شیر برای کسانی که فاقد آنزیم لاکتاز هستند مشکل ساز است. این مشکل بیشتر در آسیا و سپس در آفریقا و آمریکای جنوبی وجود دارد. جدول 3 گالاکتوزیدازهای میکروبی را معرفی می کند.

از لاکتازهای خنثی بیشتر در تولید شیر های استریل کم لاکتوز استفاده می شود. قرص های لاکتاز نیز تولید شده اند که طبق دستور زمانی قبل از مصرف به شیر افزوده می شوند. لاکتازهای اسیدی می توانند محیط اسیدی معده را تحمل کنند و طی فرایند گوارش لاکتوز را مصرف کنند. از لاکتاز در تولید برخی نوشیدنی های لبنی و ماست سازی نیز استفاده می شود.

دیگر آنزیم ها

آنزیم هایی همچون گلوکز اکسیداز، کاتالاز، سوپراکسید دسموتاز، لاکتوپراکسیداز و سولفیدریل اکسیداز کاربردهای محدودی دارند. گلوکز اکسیداز، کاتالاز و لاکتوپراکسیداز در حفظ شیر استفاده می شوند. سولفیدریل اکسیداز برای حفظ طعم شیر طی استریل کردن استفاده می شود.